noviembre 23, 2012

Banco de sueros en medicina veterinaria y zootecnia

José Alfonso Barajas Rojas
M.V.Z. M.P.V.M, M. Sc. Ph. D.
Departamento de Microbiología e Inmunología,
Facultad de Medicina Veterinaria v Zootecnia
Universidad Nacional Autónoma de México
México, D. F. C. P. 04510

Introducción
El diagnóstico epidemiológico que permite una "acción directa" en el control de enfermedades requiere de una vigilancia de estos padecimientos seleccionadas con base en la importancia para cada país. Se requiere de un monitoreo constante que permita recabar más información sobre estas enfermedades en forma primaria en áreas de alta prevalencia e incidencia o en donde existe una transmisión activa del agente infeccioso, por lo que se deben instrumentar estrategias para tratar de cambiar la frecuencia de enfermedades que pueden ser controladas considerando el costo-beneficio de estos padecimientos. La medicina preventiva tiene por objeto impedir que los animales y el hombre enfermen por medio de programas de vacunación, manejo, sanidad y otras medidas zootécnicas, con el fin de incrementar la producción de carne, leche, huevo y otros subproductos útiles al hombre, así como de evitar las zoonosis potenciales de transmisión por éstos al hombre 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,23,24,25,26,33,34,38.. Dentro de las acciones que nos permiten tener un conocimiento de los perfiles inmunológicos de los animales para estudios retrospectivos y prospectivos, se consideran los bancos de suero.29,30,31,32,41,42,43,44,46.

Fig. 1 Selección de animales, muestreo serológico,
formación de un banco de sueros y registrobarajas1

Los bancos de suero permiten realizar estudios retrospectivos que refuerzan los estudios actuales y prospectivos. La congelación del suero produce deshidratación molecular y dimerización de las Igs. G. La degradación enzimática sobre las inmunoglobulinas dependerá de la rapidez y tipo de almacenamiento. El largo almacenamiento, produce fragmentos monovalentes FAB, resultando una declinación en la actividad específica. La descongelación y recongelación deteriora las muestras. El uso de crioprotectores o enzimas inhibidoras, reduce o elimina el deterioro de las muestras. El almacenamiento ininterrumpido a -20 C es satisfactorio produciendo poco daño en la actividad específica durante por lo menos 2 años. Siempre se debe tratar de congelar rápidamente las muestras después de colectarlas. Se debe evitar congelar muestras hemolizadas. Mantener la esterilidad en la medida de lo posible. Los sueros descongelados se deben procesar inmediatamente según lo que se pretenda, pues el retraso incrementa la proteólisis.18,19,20,21,22,23,24,27,28,29,30,35,36,37,39,40,41,44.

La selección del tamaño de la muestra de animales, la colección de sangre, el registro de los datos del animal, la separación de los sueros, su almacenaje y procesamiento e interpretación son fundamentales en el funcionamiento de un banco de sueros. Fig. 1

En el área de medicina veterinaria preventiva, la información sobre bancos de suero es escasa, pues la mayoría de los estudios se inclinan a rumiantes y cerdos. La prevención de enfermedades está muy relacionada con la higiene, sanidad y salud de los animales útiles al hombre en aspectos productivos o afectivos. De la misma forma está interrelacionada con una multitud de ciencias que sostienen las bases de medicina preventiva, entre las cuales están: epidemiología, microbiología, inmunología, patología, enfermedades infecciosas, farmacología, nutrición, ecología, estadística, higiene y salubridad pública y veterinaria. Los animales que son atacados de enfermedades transmisibles diseminan la infección en los locales que habitan, en los caminos, abrevaderos y comederos, almacenes, potreros, etcétera; de esta forma contaminan por medio de exudados, trasudados y otras secreciones; entre las más importantes se encuentran la saliva y deyecciones, las cuales siendo "virulentas" pueden transmitir dichos padecimientos a animales sanos. Para evitar su propagación es necesario aplicar buenas medidas de medicina preventiva, principalmente de higiene y desinfección por distintos métodos. 12,19,23,24,25,26,30,38

Para la prevención del contacto con agentes infecciosos y su propagación como causas de enfermedad en los miembros de una población existen varias medidas: vacunación, eliminación (sacrificio de los animales), pruebas de muestreo y tratamiento en grupo, control de vectores, control de reservorios y misceláneos, entre estos se cuenta con la higiene, desinfección y erradicación de enfermedades. 24,33,34.

La primera fase de defensa contra la enfermedad es la prevención. En este contexto una población tiene 4 fases: a) Cuarentena. Consiste primordialmente en la exclusión del organismo infeccioso de áreas geográficas en donde no ha ocurrido antes. Está es la forma más antigua que existe de medicina preventiva. b) Inmunización, higiene y profilaxis, consiste en la protección de las poblaciones específicas de enfermedades presentes en esa área geográfica. c) Educación, comprende las medidas tomadas en conjunto de instrucción y orientación de una población relacionadas con la prevención de enfermedades. d) Diagnóstico temprano, comprende todas las medidas tomadas en conjunto como métodos de diagnóstico previo a la manifestación de enfermedad de diferente índole (bacteriológico, virológico, inmunológico y toxicológico entre otros, en un grupo de animales durante el estado subclínico de enfermedad antes de la manifestación de los signos. 4,5,6,7,8,9,10,33,34,37,40

Aunados a estas medidas se encuentran el control y erradicación de enfermedades que complementan una buena medicina preventiva. El principal objetivo que se busca con estas medidas es la "protección de la salud de la mayoría a diferencia de la enfermedad de la minoría". En otras palabras, el sacrificio de la minoría como forma de protección de la mayoría. Epidemiología es la ciencia que estudia la distribución de enfermedad en tiempo, geografía y atributos humanos y frecuentemente utiliza esta información en la búsqueda de etiologías y pruebas de hipótesis de asociación. Un término más moderno es el de ecología médica, que estudia, en grupo, los fenómenos de enfermedad, su distribución y determinantes de prevalencia. 24,33,34

Los métodos de muestreo en grupo, como medidas de prevención, son utilizados generalmente en enfermedades infecciosas crónicas, teniendo importancia también en medicina humana las enfermedades no infecciosas. En el caso de la detección temprana de infecciones, éste método puede servir para establecer un control permitiendo la identificación de animales portadores (eliminadores). El objetivo es que mediante la aplicación de una prueba simple a un grupo de individuos se pueda diagnosticar o detectar la enfermedad en un estado temprano de la etapa clínica o determinar el estado de inmunidad de una población o simplemente el detectar anormalidades que pueden predisponer al individuo a una enfermedad en particular. Entre las enfermedades que afectan a rumiantes de carácter infeccioso que son posibles de ser detectadas en esta forma están la tuberculosis, brucelosis, histoplasmosis, toxoplasmosis y coccidioidomicosis entre otras. Estas actividades contribuyen con otras medidas que se toman para combatir enfermedades entre los miembros de una población, así para eliminar las causas de enfermedad que existan en el medio ambiente. 15,16,22,23,24,43,44

Un banco de sueros, es una colección de sueros planificada, catalogada, formada al azar y representativa de una población, y que es almacenada para preservar sus características bioquímicas e inmunológicas. 41,44,45.

Los objetivos de un banco de sueros son principalmente ser un recurso de material documentado en el que se pueden medir varios constituyentes séricos a corto, mediano y largo plazo, usando técnicas contemporáneas de serodiagnóstico. Asimismo permite realizar estudios retrospectivos utilizando nuevos conocimientos de técnicas, etiologías y hasta conociendo el impacto productivo y económico que han tenido ciertos padecimientos. 29,30,31,32,33,34,41,44,45

Antecedentes de los bancos de suero. En 1959 la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda su establecimiento. Se forman bancos de suero humano en Estados Unidos, Sudáfrica y Checoslovaquia. Bancos de suero animal se establecen en: Nueva Zelanda (Timbs, 1979), Australia (St. George, 1979), Louisiana (E.U.A.) y Reino unido (Maff, 1975). 29,30,41,44,46

La validez de las muestras de suero usadas en pruebas serológicas dependen de la sensibilidad y especificidad de las pruebas serológicas, la vida de almacenamiento de los sueros, la calidad de las pruebas estadísticas 13,17. y otros criterios para establecer los puntos de corte. (Los bancos de suero promueven los puntos 2 y 3).

El banco de sueros, además de usarse para el estudio de anticuerpos contra enfermedades infecciosas, puede servir para determinar: Marcadores genéticos, marcadores bioquímicos, hormonas, vitaminas y toxinas. 29,30

Las muestras de suero pueden orientar los objetivos de investigación de diferente manera como en el caso de los siguientes ejemplos:

1) Identificación de problemas importantes de salud con manifestación clínica y subclínica.
2) Establecer prioridades de vacunación.
3) Identificar riesgos en el medio ambiente.
4) Evaluar la distribución de enfermedades específicas.
5) Analizar el descubrimiento de nuevas enfermedades.
6) Evaluar campañas de vacunación.
7) Determinar la periodicidad epidémica de enfermedades específicas.
8) Contribuir al conocimiento de la etiología de enfermedades.
9) Ayudar a la valoración de pérdidas económicas debidas a ciertas enfermedades.
10) Actuar como indicador de posibles brotes de enfermedad.
11) Relacionar resultados de las pruebas con: edad del animal, sexo, raza, especie, estado fisiológico o ubicación geográfica y tipo de manejo.
12) Estudiar enfermedades zoonóticas.
13) Abastecer muestras de sueros testigos positivos y negativos para el tipo de animal y ubicación geográfica donde se presenta el problema. 29,30
Las limitaciones del banco de sueros se relacionan con:
1) La forma de realizar el muestreo limita ciertos análisis estadísticos.
2) La vida de las inmunoglobulinas se ve afectada por manejo, tiempo y forma de almacenamiento.
3) Pueden presentarse reacciones cruzadas entre anticuerpos creando dificultades en el diagnóstico del problema.
4) Una reacción positiva no necesariamente significa enfermedad o infección pasada.
5) Una reacción negativa no siempre indica ausencia de enfermedad (ejemplo: antígenos enclaustrados como Campylobacter fetus).
6) Variaciones individuales en interpretación de pruebas. 13,17
Beneficios un banco de suero:
1) Incrementa las bondades de las pruebas serológicas por mantener los sueros en optima calidad y con testigos adecuados.
2) Permite submuestreos válidos por ser planeada.
3) Abarca un muestreo al azar.
4) Las muestras individuales tienen documentación completa.
5) Se almacenan bajo condiciones controladas.
6) Pueden ser almacenados durante largo tiempo antes de ser sujetos a pruebas de diagnóstico.
7) Contiene datos de sueros existentes y además los resultados de sus pruebas.
8) Pueden complementarse con otros datos de interés como: productividad animal, clima y aspectos económicos entre otros.

Los métodos de almacenamiento de los sueros son principalmente: 1) Congelamiento: Mediante Nitrógeno líquido (a -196 °C ó -100 °C), Ultracongelamiento (- 90 °C) y Congelamiento estándar (-20 °C). 2) Discos de papel: Secado en papel filtro y almacenado a -20 °C. 3) Liofilización: Es el método óptimo pero muy caro.2,11,14,18,21,27,39,42,46

Los tipos de recipientes para almacenar los sueros deben de reunir las siguientes características: Fáciles de manejar (almacenar), fáciles de llenar, fáciles de vaciar y fáciles de identificar.

Los tipos de material de los recipientes para almacenar sueros utilizados son: Vidrio y plástico (pajillas, viales). El manejo de un banco de sueros debe realizarse por una sola persona, cuyas responsabilidades deben ser la Adquisición de muestras, procesamiento, mantenimiento de registros, control de entradas y salidas, balance de depósitos y salidas, interacción con otras colecciones y usuarios, documentar los hallazgos y resultados, elaborar las informaciones o publicaciones. 27

Los sueros pueden mantenerse en óptimas condiciones hasta por 20 años a -20 °C. Se recomienda evitar al máximo descongelar y congelar los sueros, por lo que se pueden separar los sueros en mini recipientes dentro del tubo, y solo sacar un pocillo con suero para evitar el descongelamiento de todo el suero.
Se recomienda un sistema computarizado para el manejo del banco de sueros, tomando como base los hatos, las variables registradas para cada animal muestreado son: Fecha de colección del suero, dueño y dirección del rancho, tamaño del hato, número de tubo, especie animal, raza y sexo entre otros.

En México se han venido realizando estudios epidemiológicos en ganado bovino, ovino, caprino, equino y porcino. Los bancos de suero de bovinos y ovinos que actualmente se manejan en el laboratorio de seroepidemiología del departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM se clasifican en: Altiplano: 1) Bovinos de los estados de México, Hidalgo, Puebla, Tlaxcala, Querétaro, Aguascalientes y Durango. 2) Bovinos del estado de Tlaxcala y Guanajuato (ganado de lidia). A) Ovinos del estado de Morelos. a) Caprinos del estado de Puebla y Querétaro. Con relación al trópico se tienen: .a) Bovinos de los estados de Tamaulipas, Veracruz, Tabasco, Chiapas y Oaxaca. b) Ovinos del estado de Veracruz y Tabasco. Para mayor información sobre estudios realizados en México, se puede consultar las referencias 4,5,6,7,8,9,10,11,12.

Sin embargo es responsabilidad de los clínicos de rumiantes el promover la creación de bancos de suero que incluyan primariamente a los animales que asisten a su clínica o que pueden muestrear mediante visitas especificas o en coordinación con campañas antirrábicas o aprovechando las exposiciones de estos animales.

Cuadro 1. OPCIONES DE SITIOS DE MUESTREO, CALIDAD DE LAS MUESTRAS, SESGOS Y COSTOS DEL BANCO ASI COMO FACILIDAD DE COLECTA PARA FORMAR UN BANCO DE SUEROS:

Opción de sitios de muestreo Calidad de muestras Sesgo del muestreo Costo del Banco Facilidad para colectar Estandarización de la documentación
Visitas específicas Alta Bajo Alto Bajo Alta
Otras visitas de campo Alta Bajo-alto Bajo Alto Moderada y alta
Rastros Alta Alto Bajo Alto Baja
Mercados de ganado Alta Alto Bajo-moderado Moderado Baja
Lab. de diagnóstico Baja Alto Bajo Alto Moderada y alta
Trabajo privado individual Baja Alto Bajo Moderado Moderada y alta
Colección existente Alta y baja Bajo-alto Bajo Alto Baja-alta

Para la evaluación epidemiológica de pruebas diagnosticas que se pueden hacer con un banco de sueros, para poder evaluar los resultados de las pruebas diagnósticas de laboratorio de tipo inmunológico o de cualquier otra índole, se requiere conocer los siguientes términos y consultar el cuadro 2.

a) Prevalencia real (a+c)/(a+b+c+d)
b) Prevalencia aparente (a+b)/(a+b+c+d)
c) Factor de predicción positivo a/(a+b)
d) Factor de predicción negativo d/(c+d)
e) Sensibilidad a/(a+c)
f) Especificidad d/(b+d)
g) Certeza o precisión (a+d)/(a+b+c+d)
h) Riesgo relativo (a/(a+b))/(c/(c+d)) o (a(a+d))/(c(a+b))
h) Riesgo atribuible (axd)/(cxb)

Estos parámetros se pueden obtener utilizando como ejemplo el cuadro 2:

Cuadro 2. Tablas de dos por dos, para calcular parámetros epidemiológicos
Enfermedad
Presente
(+)

Enfermedad Ausente
(-)
Positivos (+)
Ejem: ELISA
A (13)
(verdaderos positivos)
B (2)
(falsos positivos)
a+b (15)
Negativos (-)
Ejem: ELISA
C (4)
(falsos negativos)
D (11)
(verdaderos negativos)
c+d (15)
a+c (17) b+d (13) a+b+c+d = N (30)


La terminología de uso común en epidemiología de bancos de sueros 24,45 se puede encontrar en diferentes fuentes. A continuación se incluyen las más importantes:

Prevalencia real: Proporción de individuos con una enfermedad determinada por el estándar dorado como por ejemplo el aislamiento del agente infeccioso. La prevalencia también puede interpretarse como la probabilidad de que un individuo elegido al azar de una población tenga la enfermedad (sinónimo: probabilidad anterior a la prueba).

Prevalencia aparente: Proporción de individuos con una enfermedad determinada diagnosticados por métodos indirectos como por ejemplo pruebas serológicas. Mientras mas cercanos sean los valores de prevalencia real y aparente (positivas y negativas), mayor concordancia y confiabilidad de la prueba diagnostica.

Factor de predicción positivo: Es la habilidad de la prueba de detectar los verdaderos positivos.
Factor de predicción negativo: Es la habilidad de la prueba de detectar los verdaderos negativos.
Sensibilidad: Habilidad de la prueba diagnostica para detectar como animales positivos, los verdaderos positivos. Los valores son inversamente proporcionales a la especificidad, o sea que al incrementar sensibilidad, disminuye la especificidad y viceversa.

Especificidad: Habilidad de la prueba diagnostica para detectar como animales negativos, los verdaderos negativos.

Certeza o precisión: Sin error aleatorio asociado (una medición imprecisa puede desviarse del valor numérico verdadero en cualquier dirección).

Riesgo relativo: Razón entre la probabilidad de que suceda un desenlace en un período determinado en los expuestos al factor de riesgo y la probabilidad de que suceda entre los no expuestos al factor de riesgo en el mismo período. El riesgo relativo es una medida de la fuerza o del grado de asociación aplicable a los estudios de cohorte (prospectivos longitudinales) y a los ensayos clínicos aleatorios. En los de casos y controles, la razón de productos cruzados se puede utilizar frecuentemente como una aproximación al riesgo relativo.

Riesgo atribuible: Porcentaje del riesgo entre aquellos individuos expuestos al factor de riesgo que está asociado con dicho factor. Si existe una relación de causa efecto, el riesgo atribuible es el porcentaje de la frecuencia de la enfermedad que se esperaría que disminuyera entre los expuestos al factor de riesgo si ese factor se pudiera suprimir completamente.

Incidencia: Es una medida dinámica de nuevos casos de una población que contrae una infección durante un período determinado.

Prevalencia: Es una medida estática de una población que está infectada en un espacio de tiempo.

Proporción de individuos con una enfermedad determinada en un momento dado. La prevalencia también puede interpretarse como la probabilidad de que un individuo elegido al azar de una población tenga la enfermedad (sinónimo: probabilidad anterior a la prueba).

Mortalidad específica: Número de muertes como consecuencia de una enfermedad durante un año, dividido por el total de la población medio anual.

Exótico: No existente en un país en particular.

Enfermedad endémica: Se presentan cuando existen cadenas de transmisión continuas en la región afectada. Puede tener varios subniveles: hipoendémica, mesoendémica, holoendémica e hiperendémica.

Epidemia: Son los picos de incidencia de la enfermedad.

Pandemia: Es una epidemia de distribución mundial.

Zoonosis: Enfermedad infecciosa que los animales pueden transmitir al humano.

Antropozoonosis: Enfermedad infecciosa que los humanos pueden transmitir a los animales.

Epidemiología analítica. Las técnicas de epidemiología analítica se utilizan para investigar las relaciones causa-efecto, y para evaluar factores de riesgo. Existen 2 métodos: Estudio del caso control y estudios de cohorte o de grupos.

Estudio del caso control: Es un estudio retrospectivo, a bajo costo, que permite un rápido análisis de la causa después de aparecida la enfermedad.

Estudio de cohorte o de grupos: El estudio comienza con una presumible causa (exposición) y en lo sucesivo se estudia la población expuesta al virus causal para identificar los efectos o sea un estudio prospectivo. Son análisis lentos ya que requiere la obtención de nuevos datos, registro y selección del grupo control, además resulta un estudio caro. Cuando se tiene éxito la relación causa-efecto es irrefutable.

Epidemiología vírica: Estudio de los factores que determinan la frecuencia y distribución de las enfermedades víricas en la población animal, donde intervienen factores ambientales genéticos y del hospedador.

Epidemiología molecular. Utiliza métodos de biología molecular pudiéndose usar varias técnicas para analizar virus específicos en determinados brotes de enfermedad. Ejemplo: Anticuerpos. Monoclonales, determinación de "huellas" mediante el estudio del ADN y electroforesis en gel de poliacrilamida.

Modelos matemáticos aplicados a bancos de sueros. Las matemáticas son de gran utilidad para conocer las causas epidémicas y las tendencias de la incidencia de las enfermedades infecciosas. Se han desarrollado modelos que permiten estimar los modos de transmisión de la enfermedad y el tamaño de población crítico para virus animales con períodos de incubación cortos o largos, infectividad persistente o recurrente y la patogenicidad dependiente de la enfermedad. La máxima atención se ha centrado en la diseminación nacional e internacional de enfermedades exóticas en poblaciones susceptibles.

En México se han realizado diferentes estudios por Barajas y col, sobre seroepidemiología en el trópico y altiplano que han servido para formar un banco de sueros y principalmente para conocer la seroprevalencia de enfermedades en rumiantes. Asimismo esto ha generado la publicación de varios textos que sirven como referencia en programas de medicina preventiva, conocimiento de las enfermedades bacterianas, fungales y virales que le permitirán al profesional y estudiante conocer estudios realizados en México. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 46, 47, 48, 49, 50, 51.

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